Mikroskopické praktikum 1 – Výběr mikroskopu

Včelaři, jejichž ambice sahají dále než za dilema zdali jogurtový kelímek pro sběr zimní měli je lepší zakrýt původním víčkem nebo papírovým ubrouskem, mají často potřebu nahlížet pod pokličku toho, co se děje ve včelstvech. Zajímá je, zda roztoči nesou stopy groomingu či jak jsou včelstva aktuálně napadena Nosemou. A tak často zvažují potřebu mikroskopování, nákupu mikroskopu apod. Proto jsem pro Vás připravil cyklus Mikroskopické praktikum, který se čtyřmi zastaveními dotkne následujících témat:

  1. Výběr mikroskopu
  2. Potřeby, pomůcky a software
  3. Uživatelský scénář č. 1 Nosema
  4. Uživatelský scénář č. 2 Pylová zrna

Výběr mikroskopu

Několikrát jsem byl účasten diskuze včelařů ohledně mikroskopu. Obvykle to skončilo podobnými představami: 

Za cenu tohoto USB mikroskopu: očekávám takové výstupy:

Zdroj: Wikipedie

Pominu-li fakt, že výše uvedený obrázek roztoče byl pořízen elektronovým, nikoliv optickým mikroskopem, je jasné že od umělohmotného “chrastítka” nemohu očekávat kvalitní a stabilní obraz.

Pokusím se v tomto článku vyhnout popisu obecných fyzikálních principů mikroskopu, kde to jen bude možné. Tam Vás odkazuji na dostupnou odpovídající literaturu nebo internet.  V tomto cyklu se zaměříme téměř výhradně na vybrané metody optické mikroskopie pracující s viditelným světlem, finančně dosažitelné amatérskému biologovi/včelaři. Jednoduše si je rozdělíme na dvě skupiny:

  • Pozorování preparátu v průchozím světle.
  • Pozorování v odraženém světle (v našem případě při pozorování objektů, kterými neprochází světlo).

Abych dopředu “chladil” očekávání – zvětšení ve světelném mikroskopu je omezené vlnovou délkou viditelného záření. Předměty, jejichž velikost je srovnatelná s vlnovou délkou světla, nelze vzájemně rozlišit. Největší zvětšení ve světelném mikroskopu, o které má smysl se v domácích podmínkách pokoušet, bude cca 1000×.

Nyní si pojďme propojit mikroskopickou metodu, zvětšení a uživatelský scénář včelaře. Dostaneme tak základní podmínky pro výběr vhodného mikroskopu:

Uživatelský scénář →

Metoda a zvětšení ↓

Inseminace včelích matek Sledování groomingu na uhynulých roztočích Základní, kvalitativní pylová analýza medu Kvantifikace napadení včelstva nosemou
Metoda Odražené světlo Odražené světlo, lze použít i průchozí Průchozí světlo Průchozí světlo
Požadované zvětšení 20-30× 20-40× 800-1200× 600-800×

Pro každou metodu potřebujeme malounko odlišný typ mikroskopu. 

 

Metoda Odražené světlo

Nejjednodušší technickou pomůckou pro práci s odraženým světlem je lupa, případně binokulární lupa. Záměrně píšu binokulární (tj. pro dvě oči), protože pro naše pozorování potřebujeme mít vjem prostorovosti. 

Poznámka

Různí prodejci optických zařízení dělají chaos v označení přístrojů lupa a mikroskop pro pozorování v odraženém světle. V našem článku budeme pojmem LUPA označovat optický přístroj, který má konstrukci, kde okulár (to k čemu přikládáme oko) a objektiv (to čím se díváme na zkoumaný vzorek) jsou obvykle integrovány do jedné skupiny čoček (případně je to jeden optický člen). Pojem mikroskop budeme používat tam, kde je konstrukčně oddělen objektiv od okulárů.

 

Takže toto je lupa (v tomto případě monokulární a s osvětlením)… …a toto je mikroskop pro pozorování v odraženém světle – v tomto případě binokulární – stereoskopický

Pokud chceme pracovat s výše uvedeným zvětšením 20-30× doporučuji některý ze stereoskopických mikroskopů, jejichž výhodou je trojrozměrné zobrazení a přímý obraz . Vzhledem k tomu, že se většina našich čtenářů nevěnuje inseminaci včelích matek, položím větší důraz na pozorování v průchozím světle.

Metoda Průchozí světlo

Tímto jsme se dostali k nejvíce používané mikroskopické metodě a předobrazu toho, co si běžný člověk představí pod pojmem mikroskop. Než si projdeme, na co si dát pozor při výběru mikroskopu, přikládám stručný “obrázkový slovníček” základních komponent mikroskopu:

Stativ

K čemu to slouží

    • Klíčová komponenta – drží mikroskop pohromadě.

Na co si dát pozor při pořizování 

    • Pokud máte ambice pracovat s vyššími zvětšeními, uvědomte si, že každá nepřesnost nebo vůle způsobí ve finále to, že nebudete schopni zaostřit nebo fixovat obraz. 
    • Pozorování se může změnit v noční můru roztřesených optických frustrací jen díky umělohmotnému stojánku vydávanému za seriozní stativ.
    • Rezignujte na různé umělohmotné konstrukce. 
    • Poctivá ocel resp litina, opracovaná evropskými standardy dá Vašemu pozorování pevný základ.

Okulár

K čemu to slouží

    • Je to optický člen, jehož úkolem je promítnout na sítnici pozorovatele zvětšený obraz. 
    • Asi víte, že celkové zvětšení optického mikroskopu se určí jako zvětšení okuláru x zvětšení objektivu. Dále bychom měli vědět, že se zvětšením okulárů resp. objektivu klesá jejich světelnost. 
    • Okuláry se obvykle vyrábí se zvětšením 10× a 20×.

 

Vlevo okulár se zvětšením 10×, vpravo 20× Všimněte si rozdíl ve velikosti vstupní čočky u okuláru 20× (vlevo) a 10× (vpravo) – jsme u té světelnosti.

Na co si dát pozor při pořizování

    • Při vybírání okuláru je zásadní vybrat takový okulár, který nejlépe odpovídá danému objektivu − s ohledem na světelnost, ohniskovou  vzdálenost a numerickou aperturu objektivu.
    • Vyvarujte se “plastové” optiky a dbejte na to, aby všechny optické členy byly vyrobeny z kvalitního optického skla.
    • U běžných mikroskopů se používají průměry 23.2 mm  a 30.5 mm. Zaměřte se na to, aby Váš výrobek byl kompatibilní s těmito rozměry. 
    • Umožní to další rozšiřování – okuláry s měřící stupnicí, fotografické adaptéry, fotoaparáty pro mikroskopii apod.
    • Pokud budete chtít do začátku experimentovat s jednoduchou mikrofotografií prostřednictvím fotomobilu, myslete na to, že budete muset používat okuláry, které mají velikost vstupní čočky srovnatelnou s objektivem fotoaparátu – dobře k tomu právě využijete okuláry 20×.

Dilema – monokulár, binokulár nebo trinokulár?

Když jsme u těch okulárů – budete si muset vyřešit dilema, zda-li si pořídit mikroskop:

Monokulární – s jedním okulárem

Binokulární – s dvěma okuláry. Světelné paprsky do nich jsou distribuovány pomocí skleněného hranolu umístěného ve stativu. Poznámka – nešetřete a volte mikroskop, který umožňuje seřízení mezipupilární vzdálenosti (vzdálenost mezi očima).

Trinokulární – s dvěma okuláry a portem pro připojení fotoaparátu.

Provedení Výhoda Nevýhoda
Monokulár

  • Nižší pořizovací náklady
  • Absence prostorového vjemu.
  • Problémy při fotografování – chybí možnost vidět obraz v mikroskopu, pokud fotografuji.
Binokulár

  • Prostorový vjem
  • Vyšší pořizovací náklady.
  • Při fotografování je nutno fotoaparát fixovat místo okuláru – obraz v mikroskopu můžeme sledovat jen jedním okulárem. 
  • Fotoaparát je v okuláru instalován v poloze, která může u některých typů fotoaparátu nadměrně zatěžovat konstrukci stativu.
Trinokulár

  • Prostorový vjem 
  • Ideální pro fotografii.
  • Vyšší pořizovací náklady.

 

Objektivy

K čemu to slouží

    • Jsou naprosto klíčovou komponentou mikroskopu. 
    • Promítají obraz zkoumaného předmětu do obrazové roviny okuláru.

Na co si dát pozor při pořizování

    • Na jednu stranu Vám budu udílet “hraběcí rady” – na objektivech nikdy nešetřete. Na druhou stranu, když se trochu porozhlédnete, zjistíte, že rozdíly v cenách objektivů jsou propastné – tu nabízí objektiv v ceně cca. 2 000 Kč, jinde je k mání objektiv se stejným zvětšením za 40 000 Kč. 
    • V čem je ten rozdíl? Pominu-li fakt, že rozdíl může být v typu mikroskopie (např. fluorescenční mikroskopie pracuje s optickými materiály, použitelnými i pro jiné vlnové délky, než má viditelné světlo), ale hlavní příčina se jmenuje KOREKCE OPTICKÝCH VAD. Co to jsou ty optické vady, že jejich redukce nás může stát tolik peněz? Inu – reálné objektivy jsou vyrobeny z reálných materiálů (na rozdíl od fyzikálních rovnic) a v praxi mají celou řadu zobrazovacích vad:
      • Sférická vada
      • Zklenutí obrazu
      • Soudečková a podušková deformace obrazu
      • Chromatická odchylka atd.
    • To, pro korekci jaké chyby je objektiv navržen, se často promítá do jeho názvu:
      • Achromatické objektivy potlačují chromatickou vadu pro dvě barvy spektra. 
      • Planachromatické objektivy mají dobře odstraněnou vadu způsobenou vyklenutím čočky. Jsou současně zaostřené okraje zorného pole i jeho střed. Při střídavém pozorování při okraji a ve středu zorného pole tak není nutné doostřovat.
      • Apochromatické objektivy velmi dobře odstraňují barevné aberace.  V porovnání s achromáty poskytují ostřejší obraz v jasnějších barvách. Jsou perfektní pro mikrofotografii.
Co je napsáno na objektivu Co to znamená v praxi
E Plan 

60× / 0.58

∞ / 0.58

Planachromatický korigovaný na nekonečno

Zvětšení 60×

Numerická apertura 0.58

Kalibrováno na krycí sklíčko o tloušťce 0.17mm

Plan 100/1.25 Oil

160 / 0.17

Planachromatický korigovaný na 160 mm

Zvětšení 100×

Numerická apertura 1.25

Kalibrováno na krycí sklíčko o tloušťce 0.17mm

Určeno pro použití imerzního oleje

 

    • Co je to ta numerická apertura? Pro jednoduchost – čím větší je numerická apertura pro dané zvětšení, tím světlejší je obraz. Jak jsem psal výše:- větší zvětšení snižuje jasnost obrazu.
    • Z mého pohledu je ideální sada objektivů se zvětšením 4×, 10×, 40× nebo 60× a 100x. Ideální je, aby byly objektivy v sadě parfokální, tj. abyste při výměně objektivu nemuseli přeostřovat resp. abyste přeostřovali minimálně. 
    • Vzdálenost mezi frontální čočkou objektivu a preparátem je u objektivů 40× resp. 60× a 100× velmi malá. Zkontrolujte si proto prosím, aby tyto objektivy měly tzv. “pružinkovou” konstrukci. To v praxi znamená, že když v zápalu pozorování dojedete objektivem na rovinu krycího sklíčka, nevšimnete si toho a budete dále posouvat stolek s preparátem proti objektivu, tak se teleskopická konstrukce frontálního členu objektivu o několik mm zasune dovnitř objektivu a nedojde tak k poškození objektivu nebo preparátu.
    • Většina objektivů se zvětšením 100× je navržena pro použití imerzního oleje. Ten je třeba kápnout na krycí sklíčko tak, aby olej vytvořil kompaktní prostředí spojující frontální čočku objektivu s krycím sklíčkem – bez bublin vzduchu. Tím, že imerzní olej má index lomu blížící se sklu, dojde k vylepšení optických vlastností při pozorování s tímto zvětšením. Pozor – imerzní olej nechte vždy několik hodin stát, aby ze sebe vypudil bublinky vzduchu.

Křížový stolek

K čemu to slouží

Zařízení, které umožňuje pohybovat podložním sklíčkem (a tím pádem preparátem) ve směru osy X a Y. Velmi dobrá věcička. Neumím si představit, jak při větších zvětšeních manipulovat smysluplně preparátem.

Na co si dát pozor při pořizování

Zkontrolujte si, zdali i při větších zvětšeních:

      • Pohyb je kontinuální a není trhaný v celé dráze pohybu.
      • Po dosažení požadované polohy preparátu nedochází k samovolné změně polohy, např. vlivem vnitřních pnutí v mechanismu stolku apod.

Ostření

K čemu to slouží

Posouvá zkoumanou část preparátu do ostřící roviny objektivu.

Na co si dát pozor při pořizování

Zaměřte se na následující vlastnosti:

      • Ostřící mechanismus by měl mít možnost “hrubého” ostření a “jemného” doostření. Ergonomicky nejlépe na jednom ovládacím prvku.
      • Ostření by se mělo měnit plynule bez zadrhávání a přeskoků.
      • Po zaostření by nemělo dojít k samovolnému rozostření např. váhou stolku s preparátem.
      • Pro mikrofotografii by měl být stolek vybaven aretací ostřící roviny – šroubem, který uzamkne vůči sobě pozici hlavy s objektivy a stolku s preparátem.
      • “Feature” navíc může být nastavení napětí/tuhosti ostřícího mechanismu – není podmínkou.

Kondenzor a jeho ovládání

K čemu to slouží

Kondenzor koncentruje světlo směrem k preparátu (obvykle v souměrném kuželu). Bývá doplněn polní clonou, která upravuje úhel paprsků u vrcholu kuželu.

Pokud je clona otevřená, je úhel paprsků větší a pozorovaný obraz ztrácí barevnou hloubku a kontrast. Je-li přivřená, je úhel paprsků menší a obraz má barevnou hloubku a kontrast, současně je ale tmavý a postupně nezřetelný.

Na co si dát pozor při pořizování

U běžných typů mikroskopů se obvykle používá Abbého konstrukce kondenzoru. Pro naší mikroskopii omezenou shora zvětšením cca. 100× je osvědčená. Zaměřte se na tyto vlastnosti:

      • Kondenzor by měl být doplněn irisovou polní clonou, která umožní upravovat úhel paprsků kužele světla vytvořeného kondenzorem.
      • Kondenzor by měl být doplněn stabilním mechanismem, který umožňuje měnit jeho vertikální polohu vůči preparátu a vhodně pracovat s kontrastem obrazu.
      • Pro seřízení/vycentrování polohy kondenzoru vůči optické ose mikroskopu by měl být kondenzor vybaven jednoduchým mechanismem – obvykle tři stavěcí šroubky.

Zdroj osvětlení

K čemu to slouží

Vzhledem k tomu, že se připravujeme provozovat mikroskopii ve viditelném světle, je to podmínkou nutnou pro prosvětlení, případně nasvětlení pozorovaného vzorku. Doby, kdy byly mikroskopy vybavovány odrazným zrcátkem jako zdrojem světla, jsou pryč. Stejně tak jsou pryč doby, kdy musely mít laboratoře Pasteurova ústavu velká okna (a v zimě výzkumníci bádali v kabátech):

Dnes jsou mikroskopy vybaveny vesměs umělými zdroji světla (obvykle) ve spodní části stolku mikroskopu. Osvětlovací soustava je rovněž doplněna optickým členem, který zajišťuje, že paprsky ze zdroje osvětlení vstupují do kondenzoru jednou optickou rovinou.

Na co si dát pozor při pořizování

U výše popisovaných kategorií mikroskopů je vaše volba obvykle omezena na následující postupku:

      • Zdroj světla – halogenová žárovka nebo LED zdroj.
      • Pokud LED zdroj – napájení jen z el. sítě nebo el.síť + baterie.

Osobně preferuji halogenovou žárovku (pardón, topné tělísko, klasické žárovky jsou již mimo zákon). 

      • Halogen mi vyhovuje svým spojitým spektrem světla a tudíž možnosti použití barevných filtrů (modrého resp. zeleného). U řady LED zdrojů můžete být nemile překvapeni buď jejich monochromatičností, případně tím, že výsledná “barva” je kombinována ze dvou monochromatických LED zdrojů.
      • V neposlední řadě jsou halogenové žárovky lépe dostupné než některé specifické typy LED zdrojů.

Co a kde si tedy pořídit?

Odpověď na tuto otázku je na Vašem rozhodnutí, Vašich včelařských cílech a finančních možnostech. 

Než ale budete nakupovat něco “nového”, vězte, že řada použitých mikroskopů se čas od času objevuje na různých internetových bazarech, ať už z produkce podniku Meopta, Carl Zeiss apod. To je přesně ta “stará práce”, jejíž kvalita trvá. Dá se pořídit za rozumné peníze. Pozor ale na různé šízuňky. Sám jsem takovému “prodejci” mikroskopu svého času málem naletěl – prodávaný Zeiss “originál mikroskop” s objektivy dalších třech výrobců atd. atd.

Zkuste si mikroskop dočasně vypůjčit ze školy či od známých a na základě vlastní praxe vybírejte, co si pořídíte vlastního (a zdali vůbec).

Pokud hledáte úplně to nejlevnější řešení z papíru – mrkněte zde: A 50-cent microscope that folds like origami

Těším se na Vás u dalšího dílu praktika. 

 

1 komentář

  1. Pingback: Mikroskopické praktikum II - Hrrr na Nosemu - Včelaři sobě

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *