Mikroskopické praktikum II – Hrrr na Nosemu

Včelařská sezóna je v plném proudu, tak máme dobrou příležitost začít se zabývat jedním z klíčových patogenů sužujícím naše včelstva – mikrosporydii rodu Nosema.

Nosema apis (NA) nebo Nosema ceranae (NC)

Nechci v intencích tohoto článku zabředávat do detailní biologie obou výše zmiňovaných druhů. Pro jednoduchost naší práce si dovolím zavést tyto dva předpoklady:

Rozšíření Nosema ceranae je v naší republice dominantní, proto můžeme pro naše pozorování v rámci včelařské „citizen-science“ generalizovat jako pozorování NC.

Svoji argumentaci podepírám závěrem z práce (1). Práce je téměř 10 let stará, nicméně z pohledu dynamiky, kterou NC „převrstvila“ NA velmi vypovídající:

Rok NA NC NA + NC
2008/09 91,3 % 7,6 % 1,1 %
2009/10 68,5 % 21,9 % 9,6 %
2010/11 28,4 % 54,1 % 17,1 %

Data demonstrující dynamiku s jakou NC nahrazovala NA jsou převzaty z práce (1).

Pokud budeme mít pochybnosti, zdali se opravdu jedná o NC, budeme spoléhat pouze na morfologii sporidií (většina z nás nemá přístup ke kvantitativnímu PCR).

Pokud budeme na pochybách o tom, co vidíme pod mikroskopem, budeme se držet následujících morfologických kriterií:

  • Spory NA jsou mírně větší než spory NC.
  • Měření v (1) uvádí průměrnou velikost spor NA 5,8 x 3,3 µm.
  • Spory NA jsou více „kulatější“, kdežto spory NC mají spíše tvar válečku.
  • Měření v (1) uvádí průměrnou velikost spor NC 4,6 x 2,5 µm.

Příprava vzorku

  • Základem celého postupu je jeho OPAKOVATELNOST. Ta je nezbytná proto, abychom dlouhodobě porovnávali porovnatelné.
  • Na webu naleznete celou řadu postupů. Klasikou je asi postup Randyho Olivera. Tímto postupem jsem se zčásti také inspiroval, protože je v článku řada praktických zjednodušení pro amatérské resp. „polní“ podmínky.
  • Sběr včel – metodikou sběru včel určujete, kterou část populace chcete sledovat. Pro rychlý „scan“ se mi osvědčilo odebírat létavky na česně. Buď můžete použít malý aku-vysavač nebo vložte přímo do česna malý mikroténový sáček a z něj včely vyberte. Tuto metodu tuším používal autor práce (1). Já používám aku vysavač:

  • Počet odebraných včel – klíčový faktor pro další kvantifikace našich pozorování. Při určování počtu včel balancujeme mezi potřebou mít co nejnižší počet odebraných – tedy usmrcených včel na straně jedné. Na straně druhé bojujeme se statistikou. Proč? Pokud budeme mít malý nízký počet včel ve vzorku, může nám výsledek ovlivnit pouze jedna infikovaná včela – musíme mít na paměti, že v jedné včele může být  až půl miliardy spor NC. Z tohoto pohledu jsem převzal a mírně modifikoval Randyho postup – odebírám mírně nad 30 včel (abych měl jistotu, že jich budu mít 30).
  • Následně včely usmrtím.
  • Usmrcené včely rozdělím po deseti do malých zip sáčků a do každého sáčku ke včelám doplním 10 ml etylalkoholu.
  • Následně prázdnou láhví od kečupu včely v sáčcích rozdrtím.
  • Ke každému sáčku s takto připraveným vzorkem si připravím kus zalomené špejle, jedno popsané podložní sklíčko.
  • Jedním koncem ulomené špejle naberu kapičku vzorku ze zip sáčku.
  • Druhým koncem špejle naberu nepatrné množství karbol-fuchsinového barviva nebo methylové modří a kapičku s ním obarvím. Toto provádějte pouze pokud budete spory počítat automatizovaně z fotografií. Při manuálním počítání spor tento krok přeskočte.
  • Přiložím krycí sklíčko a mikroskopuji.
  • Potom jak sáček se zbytkem vzorku, tak použitou špejli hodím do odpadu.

Tímto postupem mám zajištěnu:

  • Prevenci proti infikování vzorků mezi sebou.
  • Usmrcení (neboli jak se v mikroskopii říká fixaci) NC. Sporidia klesnou na dno kapičky a dále se nepohybují.
  • Karbol-fuchsinem obarvím natrávené zbytky pylu a jiné části, obsažené v orgánech včel, kdežto sporydia NC karbol-fuchsin nepřijmou. Proto mohu pro počítání spor použít počítač.

Vzorky máme připraveny, jdeme mikroskopovat.

Mikroskopie

Po našem předchozím dílu Mikroskopického praktika netřeba zdůrazňovat, že jdeme nosemu pozorovat optickým mikroskopem. Doporučuji následující postup:

  • Se vzorky příliš netřeseme. Sporidia máme usazená na dně kapičky pod krycím sklem a nechceme, aby se během pozorování resp. počítání příliš pohybovaly – preventujeme situaci, kdy bychom jednotlivé spory započetli opakovaně.
  • Začněme se zvětšením cca 100x. Při větší cloně a vhodném nastavení kondenzoru lze občas spatřit spory jako malinké body.
  • Pokračujeme s úpravou zvětšení na cca 400x. Po úpravě kuželu světla kondenzorem (tak aby paprsky světla na spory dopadaly pod větším úhlem) již vidíme jednotlivé spóry:

Foto: Archiv autora

  • Požadované nastavení kondenzoru poznáte tak, že spory začnou jakoby fluoreskovat (píši jakoby – o žádnou fluorenscenci se v tomto případě nejedná).
  • Moje osobní pomůcka – kolem spor NC se při změně zaostřovací roviny udělá taková kontrastní linie po obvodu obrazu spory.
  • Pokud jste v tuto chvíli na pochybách, zdali se jedná o NC nebo NA (a pokud to umožňuje Váš mikroskop) zvětšete zvětšení na cca 800x nebo 1000x ať můžete svoji observaci potvrdit:

Foto: Archiv autora

Poznámka k biologii NC

Uvnitř spory se nachází zárodek – sporont. Kolem něj je svinuto jako pružina duté pólové vlákno. To se v určité fázi vývoje vymrští a jako miniaturní injekční jehla pronikne do buňky střevního epitelu postižené včely. Tím dutým vláknem zabodnutým do střevní buňky se dostane zárodek ze spory ven. Vlákno ze spory „vystřelí“ v její polární části. Neměl jsem nikdy čas se na toto zaměřovat při mikroskopii. Přesto přikládám jeden obrázek, kdy jedna ze spor je již těsně před „vystřelením“ vlákna:

Foto: Archiv autora

Poznámka k fotografování NC

Vlastním pouze amatérský cca. 2 Mpixelový „fotáček“ pro vložení do okuláru. Je tím dosti poznamenaná kvalita přiložených fotografií (nízká rozlišovací schopnost, vysoký šum při nízké intenzitě osvětlení), za což se omlouvám. Nicméně pro účely amaterského „počítače spor“ je kvalita dostatečná.

Počítání spor

Chvíli se zastavím u počítání spor. Připravil jsem zde dva scénáře:

Spory budete počítat občas

V tomto případě nic neřešte. Spory v zorném poli prostě sečtěte a výsledek si zaznamenejte.

Spory budete počítat častěji

V tomto případě zvažte, jak si práci maximálně zjednodušit a finančně při tom „nevykrvácet“. Já jsem po nějakých úvahách opustil klasické metody postavené na počítacích komůrkách a speciálních sklech pro mikroskopii – vysoká nákladnost a pracnost jejich desinfekce. Přešel jsem na kombinaci výše zmiňovaného levného okulárového fotoaparátu a free open source software Ilastik. Jedná se o balík funkčností, postavený na využití neuronových sítí a dalších metod tzv. „umělé inteligence“, který i běžný uživatel může natrénovat k tomu, aby mu počítal s celkem rozumnou úspěšností spory NC z pořízených fotografií. Postup je přímočarý:

  1. Vyberete vhodné fotografie, které nejlépe charakterizují Vaše vzorky.
  2. Zvolíte scénář Cell density counting.
  3. Prostředky programu označíte, které části obrázku reprezentují spory a které nezajímavé artefakty (typicky natrávená pylová zrna apod.). Právě pro odlišení nezajímavých částí používám ten výše uvedený krok s barvivem. Výše uvedené typy barviva totiž fixované spory neabsorbují, na rozdíl od pylových zrn a jiných artefaktů.
  4. Sledujete úspěšnost učení programu ve vybraných částech obrázku:

Na obrázku jsou patrná natrávená pylová zrna, obarvená methylovou modří.

6. V okamžiku, kdy jste spokojeni, uložíte si treningová data, která používáte k rutinnímu vyhodnocování Vašich pozorování.

Pokud k tomuto budou nějaké detailní dotazy, můžeme probrat v diskusi pod článkem.

Interpretace výsledků

Pro vlastní potřebu jsem v první fázi používal poměrně komplikovaný přepočet, který stanovil vztah mezi počtem spor na části zorného pole mikroskopu, zachyceného fotoaparátem a pravděpodobným počtem spor v jedné včele, z nichž byl vzorek připraven. Nakonec se mi jako dostatečně vypovídající osvědčila poměrně jednoduchá interpretace Randyho Oliviera, uvedená ve výše citovaném odkazu:

  • Při rozlišení 400x určím počet spor.
  • Počet dělím pěti a získám odhad počtu spor na jednu včelu vzorku v miliónech.

Nekamenujte mě. Je to brutální empirie, ale když jsem ji zpětně srovnal s pracnými výpočty, tak funguje překvapivě dobře.

Amatérská interpretace může potom vycházet např. z následující škály:

  • Žádné spóry – vše OK, ideální stav.
  • Do cca 1M spor na včelu – NC je v oportunní fázi. Je ve včelstvu přítomná, ale klinické příznaky nejsou patrné.
  • Nad 1M spor na včelu – nutno zvýšit bdělost a sledovat stav včelstva.

Hodně úspěchů při Vašich zkoumáních.

Bibliografie

  1. Výzkumný ústav včelařský, s. r. o. (2011). Rozšíření, patogeneze a návrh opatření v chovech včel ohrožených mikrosporidií Nosema ceranae.
  2. Randy Olivier. Sick Bees – Part 13: Simple Microscopy of Nosema for beekeepers. http://scientificbeekeeping.com/sick-bees-part-13-simple-microscopy-of-nosema/

3 komentáře

  1. MUDr. Vladimír Šumera Reagovat

    Nosemu ceranae považuji za hlavní příčinu hromadných úhynů včelstev.
    V dubnu 2019 jsem na Včelařskén fóru zveřejnil tuto svou hypotézu:
    ,,Hlavním viníkem většiny hromadných úhynů včelstev v ČR je nosema.
    Ta v některých případech umožní masivní infekci viry nebo bakteriemi rozrušením peritrofické membrány včel, v některých úhyn sama způsobí.

    Hypotéza znamená výpověď, jejíž platnost se pouze předpokládá, ale je zároveň formulovaná tak, aby ji bylo možno potvrdit nebo vyvrátit. (Wikipedie)
    Terminologie k této hypotéze:
    Většina – více než 50%
    Hromadný úhyn: Shodněme se na více než 10% včelstev na stanovišti.
    Do statistik pro tuto hypotézu nepatří úhyny spojené s devastací úlů např přírodní katastrofou, zvěří nebo vandalem, prokazatelné otravy, ani likvidace včelařem např. vyhladověním nebo povinným spálením.“
    Nepředpokládám, že by výzkumná pracoviště měla snahu potvrdit či vyvracet tuto hypotézu. Proto budu vděčen každému, kdo bude mít k disposici mikroskopické vyšetření včelstev na nosemu
    při hromadném úhynu a pošle mi to mailem. Stačí i výsledky z pár včelstev.
    Zejména přivítám jakoukoliv zkušenost s ,,léčením“.

  2. Tomáš Ivanský Reagovat

    Dobrý den,
    osobně jsem v názorech trochu rozkolísaný v tom co je příznakem a co následkem. Jak NC, tak řada viróz se často projevují jako oportunistické patogeny, které jsou ve včelstvech detekovatelné bez zjevných klinických příznaků. Teprve až dojde k dysbalanci zdravotního stavu včelstva, dostanou se ke slovu tito oportunisté. Klinické příznaky NC jsou problémem, protože prostě nejsou v úlu viditelné – postižené včely umírají venku, mimo úl. Bez kálení a jiných učebnicových příznaků známých u NA. Každopádně se jedná o velmi zajímavé téma. Pokud budete mít chuť přispět článkem k objasnění této problematiky, velmi to uvítáme.

Napsat komentář

Vaše emailová adresa nebude zveřejněna. Vyžadované informace jsou označeny *